Bioetanol adalah etanol yang dibuat dari biomassa yang mengandung komponen pati atau selulosa. Bahan baku bioetanol dapat diperoleh dari berbagai tanaman dengan komponen utama glukosa yang diperoleh dari hidrolisis pati dengan cara kimia atau enzimatis.Pada penelitian ini dilakukan analisis glukosa tepung umbi uwi dengan tiga tahap yaitu : Proses hidrolisis kimiawi menggunakan HCl sebagai katalis, proses liquifikasi dengan bantuan enzim α-amilase dan proses sakarifikasi dengan bantuan enzim glukoamilase. Proses hidrolisis dilakukan denga variasi berat tepung uwi 40 sampai 100 gram serta konsentrasi HCl berturut-turut 2 sampai 5%, proses liquifikasi dilakukan dengan variasi unit enzim α-amilase40 sampai 100 unit/gram serta variasi suhu 60 sampai 90oC dan proses sakarifikasi dilakukan dengan variasi unit enzim glukoamilase 40 sampai 100 unit/gram serta variasi suhu 40 sampai 70oC.Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada proses hidrolisis diperoleh kadar glukosa tertinggi pada berat tepung uwi 60 gram dan konsentrasi HCl 5% yaitu sebesar 6,28%(b/v), pada proses liquifikasi diperoleh kadar glukosa tertinggi pada 80 unit enzim α-amilase dengan suhu 90oC yaitu sebesar 8,49%(b/v), dan pada proses sakarifikasi diperoleh kadar glukosa tertinggi pada 100 unit enzim glukoamilase dengan suhu 70oC yaitu sebesar 12,12%(b/v).Sampel yang mempunyai kadar glukosa tertinggi pada proses sakarifikasi difermentasi selama 4 dan 5 hari. Hasil fermentasi didestilasi untuk mendapatkan bioetanol yang murni. Hasil destilasi selanjutnya di analisis kadar etanolnya dengan menggunakan Gas Chromatografi (GC). Konsentrasi etanol terbesar dicapai pada waktu fermentasi 4 hari yaitu sebesar 87,4149%.