Bioetanol merupakan etanol yang berasal dari sumber hayati misalnya tebu nira sorgum, ubi kayu, ubi jalar, jagung, jerami, dan kayu. Bahan baku pembuatan bioetanol terdiri dari bahan-bahan yang mengandung pati (karbohidrat, glukosa dan selulosa). Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah rumput laut Eucheuma cottonii. Mengingat besarnya manfaat dari senyawa alkohol serta tersedianya bahan baku yang banyak dan mudah didapatkan maka dilakukan penelitian untuk mengolah rumput laut Eucheuma cottonii ini sebagai bahan alternatif penghasil bioetanol. Dalam penelitian ini dilakukan proses preatreatment ultrasonik pada suhu 40oC dalam waktu 30 menit untuk memecah dinding lignin agar enzim dapat menghidrolisa selulosa menjadi glukosa. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi optimum pembuatan bioetanol dari rumput laut Eucheuma cottonii secara sakarifikasi dan fermentasi simultan menggunakan mikroba penghasil enzim selulase yaitu Aspergillus niger dan mikroba yang umum digunakan untuk fermentasi Saccharomyses cerevisiae. Proses sakarifikasi dan fermentasi secara simultan dilakukan selama 7 hari dengan variasi yeast inokulum 10%, 20%, dan 30%. Pengukuran kadar glukosa dan kadar etanol diukur dari hari ke-3 hingga hari ke-7. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi yeast inoculum 30% merupakan perlakuan terbaik dan kondisi optimum yang diperoleh pada penelitian ini yaitu pada hari ke-5 yang menghasilkan kadar etanol tertinggi selama proses yaitu 4.64%.