Kernel biji mangga mengandung 6.96 hingga 13.0% minyak yang didalamnya terkandung polifenol sekitar 98.7 mg GAE/g dan berwujud semi padat, sehingga berpotensi dikembangkan sebagai bahan baku pada produksi margarin bebas lemak trans karena tidak membutuhkan proses hidrogenasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum proses ekstraksi minyak kernel biji mangga (MSKO) dengan metode refluks bertingkat untuk memperoleh rendemen dan total kandungan polifenol (TPC) minyak yang maksimum menggunakan rancangan Central Composite Design (CCD) model Response Surface Methodology (RSM) yang terdiri dari 20 perlakuan. Analisis data dan bentuk permukaan respon menggunakan software Design Expert 6.0.8. Berdasarkan hasil ANOVA diperoleh kondisi optimum proses ekstraksi MSKO untuk pelarut n-heksan yaitu pada suhu 54.22oC, selama 5.24 jam dan jumlah pelarut sebanyak 224.32 mL dengan rendemen dan TPC yaitu 7.03% dan 67.7649 mg GAE/g, sedangkan untuk pelarut etanol 96% rendemen dan TPC minyak ditentukan dengan perhitungan langsung. MSKO hasil perlakuan terbaik kemudian digunakan dalam produksi margarin dengan minyak bekatul padi (RBO) sebagai fase olein dengan rasio MSKO:RBO 60%:40%, 70%:30%, dan 80%:20% dan diperoleh hasil terbaik pada rasio MSKO:RBO 80%:20%. Hasil analisis stabilitas emulsi, warna, daya oles dan bilangan asam margarin yaitu 98.8%, berwarna kuning kemerahan (YR), 39.751 mm, dan 2.79 mgKOH/g margarin. Adapun bilangan asam margarin telah sesuai dengan standar SNI 01-3541-2002 yaitu maksimal 4 mgKOH/g margarin.